Anticuerpos policlonales antiinmunoglobulinas de salmón: Herramientas potenciales para diagnóstico (página 2)

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

Aunque en los mamíferos hay cinco clases o isotipos de
Igs, en los peces
teleósteos sólo se ha demostrado la existencia de
una. Se trata de una macroglobulina similar a la IgM,
tetramérica, compuesta de una estructura
básica de dos cadenas H y dos L. Dependiendo de las
especies de peces, su masa molecular varía entre 600 y 800
kDa (Clem, 1971).

Para la purificación de las Igs de peces se ha
descrito una variedad de técnicas,
dentro de las que destacan la precipitación con sulfato de
amonio saturado, separación por cromatografía de exclusión por
tamaño molecular y por intercambio iónico (Acton y
col., 1971; Havarstein y col., 1988). En este trabajo, para
la purificación de las Igs de salmón, se usó
una combinación de las dos primeras.

En la figura 1A se muestra el perfil
de separación, para las Igs de salmón, obtenido al
pasar el producto
fraccionado con sulfato de amonio al 50% de saturación a
través de una columna de exclusión por
tamaño molecular de Sephacryl S-300. De los dos picos
resueltos, el primero contiene a las Igs y, el segundo, a otros
componentes proteicos y remanentes de albúmina
sérica. Esto se deduce al seguir la purificación
mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul de
Coomassie, para las distintas fracciones colectadas (fig. 1B) y
al comparar sus masas moleculares relativas con la de los
estándares. Las Igs fueron colectadas, principalmente,
entre las fracciones 29 y 31 (fig. 1B, carriles 29-31),
observándose también su presencia en las fracciones
27, 28, 32 y 33. Las cadenas H y L (fig. 1B, carriles 20-32)
alcanzaron una migración
electroforética aproximada, correspondiente a los 70 y 25
kDa, respectivamente, valores
descritos para esta Ig (Havarstein y col., 1988). En las
fracciones más enriquecidas de Igs de salmón
(29-31), éstas representan más del 80% de las
proteínas totales.

En la figura 2 se muestra el grado de
purificación alcanzado con la precipitación con
sulfato de amonio (carril 2) y luego al usar cromatografía
de exclusión por tamaño molecular (carril 3). El
sulfato de amonio eliminó la mayor parte de la
albúmina sérica, y la separación
cromatográfica generó un producto adecuado para
obtención de un anticuerpo policlonal.

Los anticuerpos anti-Igs de salmón fueron
aislados desde el suero completo del conejo inmune mediante
cromatografía de afinidad, utilizando proteína G,
la cual tiene afinidad por el dominio
Cg2 de la IgG
(Coligan y col., 1995). En la figura 3 se puede apreciar la
pureza de estos anticuerpos, antes (carril 1) y después
(carril 2) de la separación cromatográfica. Se
distingue claramente la cadena H, alrededor de los 50 kDa,
mientras la cadena L se visualiza débilmente, debido a una
baja captación del colorante, derivado del alto grado de
glicosilación de esta cadena. La presencia de una ligera
banda alrededor de los 66 kDa (carril 2) representa un
pequeño porcentaje (no más de 10%) de
albúmina sérica de conejo que permaneció
adsorbida a la proteína G. En un solo paso se logró
obtener más de un 90% de pureza.

El anticuerpo purificado mantuvo su capacidad de
combinarse con el antígeno (Igs de salmón), verificado
mediante ensayo
inmunorradiométrico (IRMA) en diluciones de por lo menos
1/100.000 (fig. 4).

Mediante inmunoelectrotransferencia, tanto contra suero
completo como contra Igs purificadas, provenientes de
salmón del Atlántico, el anticuerpo
reaccionó predominantemente con las cadenas pesadas y
livianas de las Igs. En el primer caso, la intensidad del
reconocimiento fue más débil, lo cual se explica
por la menor concentración relativa de las Igs en el suero
completo de salmón (resultados no mostrados)

Adicionalmente, mediante IRMA, este anticuerpo
demostró buena reactividad cruzada con las Igs de
salmón coho y trucha arco iris. Desde el punto de vista
diagnóstico esto es ventajoso, dado que la
utilización de un solo reactivo permitiría detectar
infecciones en diversas especies de salmónidos. La
técnica de IRMA es equivalente a la de ELISA ya que
sólo cambia la naturaleza de
la inmunosonda (radiactiva versus enzimática).

La generación de anticuerpos de esta naturaleza
no parece trivial. La etapa de purificación de las Igs de
salmónidos es un paso previo ineludible. El reactivo
generado puede ser útil en el análisis diagnóstico e investigación. Así, podría
facilitar la detección de anticuerpos dirigidos contra un
patógeno, ya sea viral, bacteriano, e incluso parasitario,
mediante técnicas de inmunofluorescencia, ensayos
inmunométricos, inmunodot e inmunoelectrotransferencia.
También podría permitir adquirir información relacionada con la inmunidad
humoral en peces salmónidos, frente al desafío con
patógenos definidos.

El enfoque experimental sería usar el anticuerpo
de conejo anti-Igs de salmón como inmunosonda de
detección de estas últimas, revelando con otro
anticuerpo dirigido contra el isotipo de la especie (conejo) en
que fue generado. Otro enfoque sería usar directamente el
anticuerpo, purificado por afinidad por el antígeno, como
inmunosonda de detección de las Igs de salmón,
unidas al antígeno del patógeno adsorbido a una
fase sólida como PVC.

Alternativamente, la unión de la IgG de conejo a
las Igs de salmón podría detectarse con
proteína A o IgG de cabra anti-IgG de conejo, ambas
transformadas en inmunosondas enzimáticas o
radiactivas.

Figura 1-A. Purificación de
inmunoglobulinas (Igs) de salmón mediante
cromatografía por tamaño molecular, utilizando
Sephacryl S-300. Las Igs, previamente precipitadas con sulfato
de amonio al 50% de saturación, eluyeron en el primer
pico (fig. 1B, fracciones 29-31). 1B. Análisis
electroforético de las fracciones de Igs de
salmón purificadas por tamaño molecular. Las
fracciones cromatográficas (26-35, 37, 44 y 46) fueron
separadas mediante SDS-PAGE, seguida de tinción con azul
de Coomassie. Las Igs eluyeron principalmente entre las
fracciones 29 y 31. En el gel se cargaron 30 µl de cada
una de las fracciones en estudio. Los números de la
izquierda representan estándares de masa
molecular.

1A. Purification of salmon immunoglobulins (Igs) by
molecular sieving chromatography using Sephacryl S-300. Igs,
previously precipitated with 50% saturated ammonium sulphate,
eluted in the first peak (Figure 1B, fractions 29-31). 1B.
Electrophoretic analysis of the purified salmon Ig fractions by
molecular sieving. Chromatographic fractions (26-35, 37, 44 and
46) were separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue.
Igs eluted mainly in fractions 29 and 31. 30 µl of each
fraction were run in the gel. Numbers to the left represent
molecular mass standards.  

Finalmente, debe destacarse que comercialmente
sólo se dispone de un anticuerpo policlonal contra Igs de
trucha (generado en cabra por Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., U.S.A.). Consultada la literatura no hemos
detectado publicaciones que describan el procedimiento
empleado para generar este reactivo. Además, su
accesibilidad a los productores nacionales es limitada al no
existir representante regional para adquirir el producto. Por
otra parte, la compañía BIOS Chile.
I.G.S.A. generó en ratones un anticuerpo policlonal contra
Igs de salmón, sin embargo, actualmente no se encuentra
disponible. Por último, el uso de anticuerpos monoclonales
murinos está restringido al anticuerpo 4C10, contra
salmón del Atlántico. Este no se produce
comercialmente, sólo se puede obtener por donación
del Instituto de Aquacultura de la Universidad de
Stirling, Escocia, por lo cual su uso se restringe a algunos
laboratorios de investigación.

Los hechos anteriores señalan, entonces, la
conveniencia de contar con un procedimiento simple para generar
el reactivo en un país cuya producción de salmónidos es de las
mayores a nivel mundial.

 Figura 4. Titulación de
IgG de conejo anti-Igs de salmón mediante IRMA.
Diluciones, por triplicado, de la IgG anti-Ig de salmón se
hicieron reaccionar con Ig de salmón adsorbida a pocillos
de cloruro de polivinilo. Se reveló con IgG de cabra
anti-IgG de conejo, purificada por afinidad y radiomarcada.
Rabbit anti-salmon Igs IgG titration by IRMA. Dilutions, in
triplicates, of nti-salmon Igs IgG were tested with salmon Igs
adsorbed to wells of polyvinyl chloride microtitration plates.
Detection was with goat IgG anti-rabbit IgG, affinity purified
and radiolabelled.

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PhD.
1. Unidad de Inmunología, Departamento de Medicina
Preventiva Animal.
2. Unidad de Patología de Organismos Acuáticos,
Departamento de Patología Animal, Facultad de Ciencias
Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Casilla 2, Correo
15, Santiago, Chile. Fax:
5417357.